La méthode LAMP : une alternative simple, rapide et économique à la PCR ?

Les tests basés sur la détection des acides nucléiques sont devenus les tests de choix pour détecter la présence d'agents pathogènes dans les prélèvements pour les diagnostics. La réaction en chaîne de la polymérase ou PCR est une procédure de test des acides nucléiques largement utilisée dans les laboratoires de diagnostic et de recherche. La PCR est une procédure qui amplifie un minuscule fragment d'ADN jusqu'à ce qu'il soit détectable sous la forme d'une bande sur une plaque de gel ou d'un signal fluorescent détectable à l'aide d'un appareil, et peut être réalisée en quelques heures. Une bonne PCR nécessite un investissement important dans des équipements tels que des thermocycleurs, un laboratoire spécialisé et un personnel formé et expérimenté.

Qu'est-ce que la méthode LAMP?

LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) est une méthode simple, rapide, sensible et précise de détection et d'amplification de l'ADN/ARN qui ne nécessite pas d'équipement sophistiqué et qui est relativement peu coûteuse. La réaction s'effectue dans un tube de microcentrifugation. L'équipement nécessaire à la méthode LAMP est simple : une pipette, des embouts de pipette jetables et un bain sec numérique. Un bain-marie ou un incubateur ordinaire, voire des thermos contenant de l'eau chaude, peuvent suffire comme source de chaleur, mais pour faciliter l'hygiène du laboratoire, un thermobloc numérique est vivement recommandé (figure 1).

Dans une application LAMP typique, le mélange du tube à essai contiendra :

• Six fragments d'ADN appelés amorces qui correspondent à la séquence d'ADN à détecter.
• Une enzyme polymérase spécifique (par exemple, l'ADN polymérase BST).
• Des tampons
• Des réactifs de soutien
• Un colorant indicateur (indicateur de pH ou colorant direct pour l'ADN)
• La transcriptase inverse pour les virus à ARN
• L'échantillon à analyser.

Ce mélange est incubé à 60-65°C pendant 30 minutes. Si l'ADN correspondant aux amorces est présent dans l'échantillon, une série de boucles d'ADN se forme. Les boucles deviennent plus complexes et plus nombreuses au fur et à mesure que la réaction d'amplification se poursuit (figure 2).

L'amplification de la polymérase comme sous-produit génère du pyrophosphate de magnésium qui provoque une turbidité (opacité) dans le tube. Les colorants indicateurs qui se lient directement à l'ADN produisent un signal fluorescent dans le spectre visible ou UV. Un système LAMP utilisant un indicateur de pH rouge phénol passe du rouge rosé au jaune.

La figure 3 montre le résultat d'un test LAMP pour la peste porcine africaine (PPA) - le tube A contenait un extrait de la rate d'une truie morte de la PPA. La teneur élevée en ADN viral génère une couleur jaune opaque. Le tube B était un écouvillon de liquide buccal de la même truie, avec la charge virale inférieure attendue. La turbidité des tubes A et B est évidente lorsqu'on examine la ligne inférieure. Les tubes C à F sont des tubes suspects et négatifs.

Il existe quelques variantes de la réaction LAMP en fonction de la technologie disponible. Le test peut être réalisé dans des microplaques scellées de 96 puits avec des colorants colorimétriques ou fluorescents ou des mesures de turbidité pour obtenir un résultat quantitatif et automatisé. Des cellules photoélectriques filtrées dans le bloc thermique et une LED appropriée pourraient également automatiser la lecture fluorescente semi-quantitative en temps réel à partir des tubes de microcentrifugation. La spectrophotométrie à l'aide de l'appareil photo d'un téléphone portable pourrait résoudre les doutes concernant les tubes suspects dans les cas où l'œil humain ne peut pas résoudre le dilemme.

La réaction LAMP peut être réalisée sur le terrain, sur place, pour des résultats pratiques sur le lieu de soins avec un temps d'attente minimal. Notre laboratoire a construit et vérifié des tests LAMP peu coûteux (à partir de zéro et à partir de kits) pour la peste porcine classique (PPC), le circovirus porcin 2 (PCV2) et la peste porcine africaine (comme indiqué ci-dessus). Nous avons cherché à valider l'idée (pour la PPC) qu'un lot de reproducteurs pouvait être testé avant l'introduction, de manière rentable, pour une infection persistante en utilisant la méthode LAMP.

Les avantages de la méthode LAMP sont la rapidité des résultats, la formation minimale requise, le faible investissement en équipement, le faible encombrement du laboratoire et le faible coût global par échantillon. Bien que les coûts puissent varier, le coût de la méthode LAMP est environ deux fois moins élevé que celui de la PCR et il est encore plus bas pour les matrices simples où aucune extraction préalable d'acide nucléique n'est nécessaire. Les laboratoires désireux d'investir dans le développement d'une méthode LAMP à partir de zéro, avec des réactifs relativement peu coûteux et des séries d'amorces créées par eux-mêmes, peuvent éviter le coût plus élevé d'un kit prêt à l'emploi, mais doivent faire face aux coûts associés au développement, à la vérification et à la certification.

La sensibilité et la spécificité de la méthode LAMP sont comparables à celles de la PCR et peuvent donner des résultats en 30 minutes. Certaines administrations ont approuvé des kits commerciaux de test LAMP pour la PPA et le Covid-19.

Les inconvénients de la méthode LAMP sont la méconnaissance de certains universitaires et chercheurs et un certain scepticisme à l'égard de la méthode. La méthode LAMP nécessite 6 (jusqu'à 8) amorces pour chaque gène à détecter et la génération d'amorces est plus difficile que la PCR conventionnelle, mais des outils en ligne sont disponibles. Dans le cas de virus à ARN hautement mutables, tels que le SDRP, plusieurs séries d'amorces peuvent être nécessaires dans le mélange, mais cela n'a pas empêché son utilisation. La méthode LAMP génère beaucoup d'ADN et, en général, les tubes positifs ne doivent pas être ouverts après le test pour éviter la contamination du laboratoire. Les amplicons LAMP ne se prêtent pas facilement à un séquençage utile et le laboratoire peut devoir recourir à la PCR conventionnelle ou à d'autres méthodes pour les échantillons LAMP positifs lorsqu'un séquençage du virus est nécessaire.

Il est facile d'imaginer l'application de la méthode LAMP dans les points de vente de bétail, les points de collecte d'animaux et les abattoirs, ainsi que dans des environnements plus rudimentaires et éloignés où il n'est pas possible de déplacer des équipements sensibles et coûteux. Lorsque des installations sophistiquées ou même l'électricité ne sont pas disponibles et que des réponses binaires oui/non sont essentielles pour une prise de décision en temps réel et sur place, la méthode LAMP pourrait constituer une solution. Le faible coût et le manque d'équipement peuvent avoir entravé la prolifération du LAMP dans une certaine mesure, car certaines entreprises et certains laboratoires universitaires peuvent préférer des installations plus coûteuses, accordant plus d'importance au retour marginal sur investissement qu'au coût réel des services d’analyses vétérinaires sur la base d'une tarification.

Alors que le monde s'oriente vers le contrôle et l'éradication d'importantes maladies endémiques transfrontalières telles que la peste porcine africaine (PPA), le syndrome respiratoire porcin ( SDRP) et la peste porcine classique (PPC), la disponibilité d'un test rapide, pratique et abordable présente un grand potentiel d'utilisation.

"Peut-être qu'être trop pratique est une folie" - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Quichotte.