SDRP : Méthodes diagnostiques

En raison des progrès dans les techniques de laboratoire, de multiples méthodes ont été commercialisées pour diagnostiquer la présence de SDRP partout dans le monde. Cet article se centre sur les méthodes de détection d'antigènes et d'anticorps en se basant sur leur utilisation par des vétérinaires de terrain aux USA

Recherche des antigénes

Isolement viral

Le SDRP peut croître sur un nombre limité et sur un type limité de lignées cellulaires, parmi lesquelles se trouvent les macrophages alvéolaires porcins ou des clones hautement permissifs de cellules MA-104. Sa capacité de se répliquer dans différentes lignes cellulaires est variable ; de cette façon l'utilisation de macrophages alvéolaires porcins avec des cellules MA-104 améliore la sensibilité des isolements viraux de SDRP.


Alors que le sérum, les leucocytes, les poumons, les lavages alvéolaires, les ganglions lymphatiques et les amygdales sont les prélèvements de choix pour l'isolement viral, l'efficacité de la détection sur la semence au moyen de cultures cellulaires est limitée par la cytotoxicité de la semence.

La présence du SDRP dans des cultures cellulaires est confirmée par l'observation d'effets cytopathologiques (ECP). On observe les ECP généralement entre 2 et 6 jours.

Du fait que l'isolement viral requiert la présence de virus viable, la sensibilité de l'essai peut être affectée par le processus de prise d'échantillons, y compris la température à laquelle ils sont conservés et l'intervalle écoulé depuis la récolte.

PCR

La PCR est une méthode enzymatique in vitro qui permet l'amplification exponentielle d'une séquence spécifique d'acides nucléiques au moyen de cycles répétés à différentes températures.

La transcription reverse-PCR (RT-PCR) a été utilisée pour détecter l'ARN du SDRP de divers échantillons comme le sérum, les tissus et la semence. C'est une méthode très sensible et rapide pour la détection du SDRP, puisqu'elle fournit des résultats en 24 à 48 h. L'utilisation de la PCR a amélioré la détection du SDRP dans la semence du verrat.

La RT-PCR nested a été décrite comme une technique extrêmement sensible pour la détection de faibles concentrations de SDRP dans des semences de verrats. Le nombre minimal de virus de SDRP par unité de volume détectés par RT-PCR nested est de 10^-30 particules infectieuses/ml, tandis que la concentration de SDRP par unité de volume était de 10^-2 à 10² TCID50/ml. En dépit d'un haut degré de sensibilité et de spécificité, l'augmentation du nombre de faux positifs liés à la contamination des amplicons est le principal inconvénient de la RT-PCR nested.

Aux USA, il y a un accord général sur les performances de la PCR Temps Réel pour détecter l'ARN du SDRP. La sensibilité de PCR TR a été décrite comme semblable à celle de la RT-PCR nested (10^-2 a 10^-1 TCID50/ml).

L'utilisation de la PCR TR élimine la nécessité d'analyser les produits de la PCR en gel d'agarose, puisque les échantillons se lisent automatiquement par un capteur fluorescent, en utilisant un système de tube fermé, ce qui prévient des contaminations. Ceci augmente la vitesse et la performance.

Séquençage de l'ADN

Les avances récentes en diagnostic moléculaire permettent la caractérisation de la région d'ORF 5 (cadre de lecture 5) par séquençage moléculaire. L'ORF 5 codifie pour la protéine de l'enveloppe virale, c'est la portion la plus variable du génome viral et elle mute fréquemment.

Ceci en fait un outil utile pour la caractérisation génétique de différents isolats de SDRP. Plus le pourcentage d'homologies entre isolats est grand, plus on peut considérer qu'ils sont proches génétiquement. Le séquençage permet aux vétérinaires de mener à bien des recherches épidémiologiques dans des foyers de SDRP ainsi que de mieux comprendre l'épidémiologie de SDRP dans des exploitations agricoles infectées chroniquement et qui ont un historique de problèmes de reproduction récurrents secondaires au SDRP.

Recherche des anticorps

Les anticorps du SDRP peuvent être détectés au moyen de la méthode ELISA et d’analyses sérologiques, comme l'IPMA (test à l’immunoperoxidase en monocouche), l'IFA (Immunofluorescence) et la séroneutralisation. Cependant, aux USA, la méthode la plus utilisée en porc est la méthode ELISA.

L'utilisation de la méthode ELISA IDDEX dans le diagnostic de la présence d'anticorps de SDRP après l'infection de SDRP a été étendue à beaucoup de pays comme les USA, le Canada, l'Asie et l’Amérique latine. Cette méthode a démontré avoir de hauts niveaux de sensibilité (100 %) et de spécificité (99,5%), et l'automatisation permet d'avoir des résultats sur de grands échantillons en 24h. Comme cela arrive avec des analyses à haute sensibilité, l’ELISA IDEXX peut produire de faux positifs lors de conditions de terrain, c'est pourquoi il est important d'indiquer qu'elle doit plus être appliquée à la détection d'anticorps au niveau de l’élevage qu'à la détection individuelle.

La présence d'anticorps de SDRP par ELISA IDEXX est déterminée en mesurant le rapport S/P (échantillon de sérum/témoin positif). Un S/P supérieur ou égal à 0 ,4 est considéré positif à l’infection par le SDRP.

L’ELISA détecte les anticorps (IgG) contre le SDRP à partir de 7 à 14 jours après l’infection, en atteignant le maximum entre 30 et 50 jours. A partir de ce moment, les titres déclinent pour atteindre des niveaux indétectables au 4^ème - 6^ème mois après infection.

La vaccination contre le SDRP, l'âge et la prévalence régionale doivent être considérées pour interpréter les résultats sérologiques car ni la méthode ELISA ni les autres analyses sérologiques ne distinguent les anticorps du SDRP entre les porcs vaccinés et ceux infectés. En outre, les porcs peuvent avoir des anticorps passifs de leurs mères (Ac maternels) jusqu'à la 3-4ème semaine d'âge.

Finalement, les anticorps du SDRP détectés par ELISA sont seulement un indicateur de l'exposition au virus, et non qu'il existe une protection face au SDRP.